顕微鏡の分解能

　凸レンズの結像倍率は、レンズから物体までと、像までの距離の比となる。物体をレンズの焦点位置に近づけていくと比は制限なく大きくなっていく。対物レンズの焦点距離が十分に短ければ実用的な鏡筒長の顕微鏡で1000倍どころか、1万倍以上の拡大だって可能であるように思えてしまう。

図：幾何光学的な像の拡大。拡大率はいくらでも大きくなる。

開口数NA

図：ピントがあった状態で光軸とレンズ最外周を透過する光線のなす角θの正弦が開口数。

　ここでnは対物レンズ前面と試料の間の媒体の屈折率で、乾燥系対物レンズなら空気の屈折率１、油浸対物レンズでは、油浸液の屈折率（約1.5)となる。sinθの最大値は１だから、乾燥系対物レンズのNAの最大値は１となる。一般に、高倍率の対物レンズほどNAは大きく、また、アクロマートとアポクロマートを比較すると、同倍率ならアポクロマートの方がNAが大きい。

NAと分解能

　クロス回折格子の観察像を用いて、(1)式の物理的背景を示す。クロス回折格子を用いているのは、後半での実験にクロス回折格子が必要であったためで、分解能の起源を理解するためだけなら、普通の回折格子で問題はない。

　今回用いたのは公称530本/mmのクロス回折格子なのだが、公称値から求めた回折角と実際の回折角が整合しなかったため、対物ミクロメータを用いて実測したところ、周期5.1ミクロン、本数にすると196本/mmであった。さて、周期ｄの回折格子の1次の回折角は次式のm=1の場合で、dとして上記の値を用い、波長を550 nmとすると、回折角は6.2度で、その時の正弦は約0.11となる。
dsinθ=mλ　…………(3)

　アッベは顕微鏡で回折格子像が観察されるためには、対物レンズに最低限1次の回折光が、0次光と合わせて取り込まれていなければならないということを見出した。言い換えれば、回折格子の1次の回折角の正弦値よりも大きなNA値の対物レンズでなければ、回折格子像は観察できないということである。

　下に、クロス回折格子像とその時の回折パターンの像を示す。回折パターンをどのように撮影したかを知りたい方は、このテキストの最後の方の「対物レンズ後ろ焦点面とベルトランレンズ」部分をご覧いただきたい。

図：クロス回折格子像と対応する回折パターン

　右側の回折パターンの中心の白色部分が回折されずに直進した0次光である。左右と上下がそれぞれの周期構造による1次と2次の回折パターン。斜め45度やそれ以外の方向にも回折が生じている。図を見ると、1次の回折には青〜赤まで可視光全域が含まれているが、外周部分では回折光の赤色部分は取り込まれなくなっていたりする。このまま議論を進めてもよいのだけれど、波長を限定した方が、現象をすっきりと観察できそうなので、単色フィルターを使うことにした。

　波長が単色化されているので、細長く伸びていた回折スポットが丸い点状になっている。斜め方向の回折スポットがなくなっているが、これは、用いた波長では回折角が大きく、対物レンズに取り込まれなかったためである。ここから、対物レンズを通過する光を制限していく。

　回折パターンの水平と垂直方向の2次のスポットが入らなくなっているが、格子像はまだ問題なく見えているように思える。

　さらに入射光を制限して、0次と上下左右の1次の回折光のみが通過している。まだ、格子構造は見えている。

　残っていた上下左右の回折スポットも透過しないようにすると、格子構造が消えてしまう。この変化は劇的なものであるが、途中経過をよく見てみると、透過するスポット数の減少に伴って、格子構造のパターンに変化が生じていたことがわかる。

　図は左から2次の回折も含まれているもの、斜めの回折も残っているもの、上下左右の1次の回折のみのものである。2次の回折も含まれているものは、はっきりと正方形の格子が見えている。しかし、2次の回折光がなくなると、明るい部分の角が丸まって、きちんとした正方格子には見えなくなっている。そして、1次の回折だけのものは、穴あきの丸が集合したような構造に見えている。3つの写真でピントは同じに保っている。

　このシンプルな観察結果は、周期的な格子構造を観察するためには、次の回折光が対物レンズに取り込まれる必要があることを示している。縞構造の周期と回折角の式（(3)）より、開口数NAの対物レンズで観察できる最も細かい周期構造の間隔は
d=λ/NA …………(4)
であると結論できる。

　格子間隔が同じでも波長が異なれば、回折角も変化する。

図に、450、500、550、600 nm光の回折パターンを示した。450nmや500nmでは見えていた回折パターンが550nmや600nmでは失われている。試みに、450nmと600nmのパターンを上下でつなぎ合わせてみた。黄色いサークルが対物レンズのNA相当である。

　単波長の光ほど回折角が小さいため、同じNAの対物レンズでも青色光なら回折光も取り込めるが、赤色光だと回折光を取り込めないといった事態も起こりうる。

図は白色光で、青色系の回折光のみ対物レンズに取り込めるように調整したものだが、この時点で、照明側のフィルターをいれて、青色光のみ、赤色光のみとしたのが次の写真である。

　当たり前の話であるが、青色光では周期構造が白色光よりコントラスト良くみえており、赤色光では見えなくなっている。ただし、見えている周期構造は決して正方格子ではなく、穴あき丸のつながりではある。

斜入射照明による分解能向上

　ここまでの議論を眺めながら、斜めから光を入射したらどうなるか気になった方もいるのではないかと思う。

図：斜入射の場合の回折光。垂直入射に比べて、回折角が倍まで対物レンズに取り込まれる。

　図に示すように、対物レンズのNAギリギリの角度で照明光をいれると、垂直入射では取り込まれることのなかった1次の回折光が対物レンズの反対側の縁をとおって取り込まれるようになるはずだ。そこで、垂直入射では０次光しか透過しない状態にして、0次光が斜めから入射するように調整した。調整した結果の画像と対応する回折像を次に示す。観察対象は上と同じ、方眼のクロス回折格子である。

図：斜めからの照明にして、一方向に関しては1次の回折光（の片側）が入射するようにしたときの画像（左）

　見ての通り、1次の回折光が取り込まれている方向に関しては周期構造が観察されている。しかし、それと垂直の0次光しか取り込まれていない方向に関しては周期構造は再現できていない。このため、実物は方眼格子であるにも関わらず、縦縞の格子として観察されてしまっている。

 　0次光を斜入射にすると、上に示されているように、斜入射にした方向の分解能は垂直入射に対して、最大で2倍ほど向上する。これは、偏斜照明と呼ばれる伝統的な技法で、1960年代ごろまでの研究用顕微鏡では普通に行える照明手法であったが、1970年代以降のシステム顕微鏡ではコンデンサが固定されてしまい、忘れられた照明手法となっている。

入射光の制限による像の変化

 　上に記したように、特定の方向の回折光のみで結像すると、もとの構造とはことなった像が形成される。上の例では、出現した周期は元の格子と同周期であったが、対物レンズ全面にスリットのあるマスクを付けて特定の回折光のみを選択すると、異なる構造が出現する。取り付けたマスクと用いた対物レンズについては後ろの方の「用いた対物レンズ」の部分に記している。

　上段はマスクを付けていない画像で、クロス回折格子像が見えている。下段はマスクを装着して上下方向の回折スポットが入らないようにしたものである。斜入射の時と同じように1方向の回折スポットしか取り入れていないため、クロス回折格子ではなく、単純な縦縞になっている。縞の周期はクロス回折格子の周期と同じである。、

　続いては、クロス回折格子を45度回転したもの。マスクなしの画像を見ると、水平方向にはクロス回折格子の対角線方向に回折したスポットが広がっている。この対角線方向のスポットのみをスリットで選択したのが下の画像。最初の画像と同様に、縦縞となっているが、縞の周期はクロス回折格子の周期より短くなっている。元のクロス回折格子の方向とは異なっているけれども、45度回転した元画像から、どのような周期を読み取っているのかは理解できると思う。

最後は、約 30度回転させたもの。上の画像をみれば、どの回折スポットを拾ったのかは理解できる。回折角が大きいため、出現した縞の周期は45度回転よりも短くなっている。1次の回折光しか拾えていないこともあり、縞のコントラストは低下している。

コヒーレント照明とインコヒーレント照明

1次の回折光が対物レンズに取り込まれることが、周期構造の観察には必要と記したけれども、この考え方は周期的な回折ピークが出現することを前提としている。

図：二重スリットによるパターン。光が干渉性の場合（上）と非干渉性の場合（下）。パターンは右側ほど二重スリットの間隔が広がったもの。

図に二重スリット実験の2つのパターンを示した。上の図では光源と二重スリットの間に単スリットが置かれている。この場合は図のように干渉パターンが観察され、スリットの間隔を広げていくと、干渉パターンは疎になっていく。一方、二重スリットと光源の間の単スリットを外してしまうと、下の図のように干渉パターンは観察できなくなり、スリット間隔が狭い時には、単一ピークの強度分布が、スリット間隔が開いていくと、2つのピークの重ね合わせとわかる構造へと変化していく。両者で異なっているのは、単一スリットがある場合には、二重スリットのそれぞれの開口部分で、光の位相が一定の関係にあり、二重スリット透過後の光が強弱となる方向も定まっているのに対して、単一スリットがないと、光源のいろいろな部分からの光が二重スリットに到達しているために、瞬間ごとに、2つのスリットの光波の位相が変化してしまい、スリット通過後の強弱の方向も時間変動してしまい、平均として特定の方向で強めたり弱めたりすることなくなってしまっているのである。

上の図のように、位相が定まって、干渉を起こす光を「コヒーレント」な状態という。それに対して下のように干渉をおこさない状態を「インコヒーレント」という。アッベの議論はコヒーレントな照明光を前提としており、照明がインコヒーレントの場合には適用できない。

インコヒーレント照明下では、スリット間隔が狭い時には、なだらかな一山形状なのが、間隔が開いていくと、2つの山の重ね合わせであることがわかるようになっていく。変化は連続なので、非干渉性の場合に、分解能を定義しようとすると、どうしても恣意的な部分が生じてしまう。一般に用いられているのはレイリーによる定義である。

図：単一ピンホールの回折パターン（左）。ピンホールが2つあると、それらからの回折の重なりとなる。

面積のない輝点を無収差レンズで結像すると、図左のようにある大きさで明暗を繰り返す（エアリーディスク）し、輝点が2つ並んでいる場合は、それぞれ独立なエアリーディスクが生じるが、一方のエアリーディスクの中心と、もう一方のエアリーディスクの最初の最小位置が重なる距離をもって、分解能とするものである。この時の分解能ｄの式は
ｄ＝０．６１λ/NA  …………(５)
となる。この定義は、本当にこの距離以下の識別ができないかを物理的に保障するものでないことには注意する必要がある。目視観察の場合には、経験的にこの式の妥当性は広く認識されているようだが、ビデオ顕微鏡によりコントラストを増強すれば、この式が示すより小さな構造の識別も可能となる。井上により開発されたビデオ顕微鏡技術である。

顕微鏡の本を眺めると、コンデンサの開口絞を絞るとコヒーレント照明になり、開くとインコヒーレント照明になると記載されている。ケラー照明状態では、開口絞には、光源像が形成されている。開口絞を十分に絞れば、光源の１点からの光による照明となり、ヤングの二重スリットの実験で、二重スリットの手前に単スリットを置いたのと同じようになる。それに対して開口絞をあければ、光源の様々な発光部分からの光が、試料を同時に照射するようになり、試料面での光の位相はランダムに時間変化するためインコヒーレント照明となる。

対物レンズ後ろ焦点面とベルトランレンズ

アッベの議論をたどる前に、もう一つだけ関連する事柄の説明をしておこう。図は二重スリットを観察するときの光路を描いたものだ（スリットは紙面に⊥に伸びている）。図の上側は通常の観察で、スリットの一方から出た光と他方から出た光は像面で拡大像として結像している。二重スリットでは、干渉が生じ、二重スリットを通った光は、明暗のパターンを繰り返す。図では直進する光（0次光）と、最初に明るくなる方向（1次光）の光線を描いているけれども、それぞれの方向について、異なるスリットを通過した光は平行に対物レンズに入射するので、対物レンズの焦点位置（後ろ焦点面）で結像する。この面で像を観察すれば、明暗の縞模様の干渉像が観察できる。

図：通常観察時の光路図とベルトランレンズをいれたときの光路図。像面に形成された画像を観察している。

偏光顕微鏡には、「ベルトランレンズ」が装着されているものもあり、このレンズを光路に挿入すると、後ろ焦点面の像が、通常の像面に結像するようになる。干渉像が直接観察できるようになる。ベルトランレンズのない顕微鏡でも、接眼レンズを外して鏡筒をのぞき込めば、後ろ焦点面の像が小さくだけれども観察できるし、センタリングテレスコープ（位相差顕微鏡のリング調整に用いるアイピース）を用いると、大きな画像が観察できる。ベルトランレンズをいれて観察できる画像を、業界では「コノスコープ像」と呼んでいる。それに対して、通常の試料の拡大像は「オルソスコープ像」と呼ばれている。

実験に用いた対物レンズ

　前半の回折光の取り込み範囲を変化させた実験ではNA可変の対物レンズを用いている。写真撮影用のレンズでは、絞り値を変えるでNAが変化するけれども、普通の対物レンズには絞りがついていないので、NAを変えることはできない。しかし、幸いなことに、顕微鏡対物レンズにも絞りが付いたものがある。

図：ニコン絞り付き対物レンズ

　写真はニコンのユニバーサルステージ用の対物レンズである。ユニバーサルステージは偏光顕微鏡の付属器具で、試料の方向をかなりの範囲で自由に調整して観察できる器具であった。このレンズは当時としては、きわめて作動距離の長い対物レンズで、ホットステージ中の液晶を観察するために用いられていたものである。

　後半の実験は、対物レンズの前に紙製のスリットを取り付けている。そのため、対物レンズ全面の径が大きく、スリットを取り付けやすい形状のものが適している。金属顕微鏡用の長作動対物レンズは全面が大きく、実験には適しているのだけれど、手持ちの有限光学系では、対物レンズ指定の鏡筒長を守ってのコノスコープ観察ができなかったので、オリンパスの生物用長作動対物レンズ(ULWDCDPlan20)を用いることにした。

オリンパスの対物レンズは対物レンズr単体では残存色収差があり、接眼レンズ系と合わせての収差補正なので、ニコンのシステムに装着すると色収差補正ができなくなるのだけれども、今回は単色光源を用いているので、安心して使用することができる。マスクは黒ケント紙の対物レンズの全面のサイズ(Φ25)に幅約0.5mmのスリットを切ったものを使っている。

画像のフーリエ変換を試してみる

　対物レンズの後ろ焦点面像は、観察される像とフーリエ変換の関係にある。というわけで、格子像をソフトウエアでフーリエ変換してみた。用いたのは回折スポットが0次光以外に4つしか含まれていないもののjpegイメージから得られた画像を実際の回折スポット像と合わせて示す。

計算したものと実際の回折像で間隔が異なっているのは、きちんとスケーリングをしていないためなので問題はない。格子構造に対応して2次元的なスポットが出現するのは納得できるのだけれど、実際のスポットと比べてパターンが広がりすぎている。こうなってしまった原因の一つとして考えられるのはjpeg画像を用いているためなので、改めてraw画像を用いてフーリエ変換像を作製してみた。raw画像をImajeJで読み込めるようにするためには、星空公団のraw2fitを用いている。

元画像と比べると、まだスポットが出すぎてはいるけれども、0次光を中心にある領域のみの周波数成分が強くなっていたりして、気分的には実際のスポットに近づいている感がある。もと画像にアポダイゼーションをかければ、もう少し似てくるかとも思っており、いずれ試してみるつもりでいる。